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Título: Efeito da l-aminoácido oxidase de veneno da serpente Calloselasma rhodostoma sobre o complexo nadph oxidase de neutrófilos humanos
Autores: Paloschi, Mauro Valentino
Zuliani, Juliana Pavan
Palavras-chave: Veneno de Serpente
L-aminoácido oxidase
Calloselasma rhodostoma
NADPH oxidase
Neutrófilos
Data de publicação: 2017
Citação: PALOSCHI, Mauro Valentino. Efeito da l-aminoácido oxidase de veneno da serpente Calloselasma rhodostoma sobre o complexo nadph oxidase de neutrófilos humanos. 2017. 61 f. :il. Dissertação (Mestrado) -Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental, Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho, 2017.
Resumo: Os componentes de venenos de serpentes são moléculas com potencial de bioprospecção nas áreas das Ciências Biomédicas. Dentre esses componentes, as proteínas L-aminoácido oxidases (LAAOs) são responsáveis por efeitos como atividades antimicrobianas em bactérias, fungos, vírus e parasitas, indução de edema, efeitos citotóxicos, coagulantes e anticoagulantes, hemorrágicos e ativação de neutrófilos. Ao entrar em contato com o agente agressor, o neutrófilo realiza o processo de fagocitose, que juntamente com a formação das espécies reativas do oxigênio (EROs) pelo complexo da NADPH oxidase ativado pela via da PKC, possui a finalidade de degradar patógenos. O complexo da NADPH oxidase é composto por proteínas citosólicas (p40phox, p47phox e p67phox), proteínas de membrana (p22phox e gp91phox) e por uma proteína de sinalização, a Rac. Com isso, o objetivo deste trabalho foi dar continuidade a caracterização funcional da LAAO isolada do veneno da serpente Calloselasma rhodostoma sobre a ativação de neutrófilos humanos, com ênfase na participação do complexo da NADPH oxidase. Para isso, foi obtido sangue periférico humano de doadores e os neutrófilos isolados por gradiente de densidade. As células foram incubadas com tampão-fosfato salina (PBS, controle negativo), acetato de forbol miristato (PMA 500 ng/mL, controle positivo), LAAO ou LAAO inativada (50 μg/mL). Após ultracentrifugação celular para separação de frações citosólicas e de membrana, separação por SDS-PAGE e transferência para membrana de PVDF em ensaios de Western blot, a expressão proteica dos componentes da NADPH oxidase foram visualizadas na presença de anticorpos específicos para cada componente (p40phox, p47phox, p67phox, gp91phox e Rac1,2,3), além das PKCs subunidade α (PKC-α) e sua forma fosforilada (p-PKC-α/β II), das ciclooxigenases (COX-1 e COX-2) e fosfolipases A2 citosólicas (cPLA2) na sua forma nativa e fosforilada (p-cPLA2). Os resultados obtidos mostraram que houve expressão das proteínas p40phox, p47phox, p67phox e Rac nas frações de membrana dos neutrófilos, demonstrando a migração dos componentes citosólicos para a porção de membrana, evento que ocorre quando o complexo é ativado. O Western blot para a proteína de membrana gp91phox mostrou reatividade para as condições testadas na fração de membrana. A ativação da NADPH oxidase se dá pela via da PKC, pois houve expressão dessa proteína tanto na sua forma nativa, quanto fosforilada. Além disso, observou-se que a LAAO induziu a expressão da PLA2 citosólica na forma fosforilada e de COX-1, porém não houve expressão da COX-2. Tomados em conjunto, os dados obtidos permitem concluir que a LAAO foi capaz de ativar o complexo NADPH oxidase de neutrófilos humanos para produção de EROs com a participação da PKC. A LAAO induziu a ativação e a fosforilação da cPLA2, contribuindo para a expressão da COX- 1. Por outro lado, a LAAO na sua forma inativada não induziu a ativação do complexo. Assim, em neutrófilos a produção de EROs é desencadeada pela ativação do complexo da NADPH oxidase induzida pela LAAO e não pela atividade intrínseca da enzima.
Descrição: Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Experimental, da Universidade Federal de Rondônia e Fundação Oswaldo Cruz de Rondônia, como requisito para obtenção do título de Mestre. Orientadora: Dr.ª Juliana Pavan Zuliani.
URI: http://www.ri.unir.br/jspui/handle/123456789/2164
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