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Title: Caracterização bioquímica e funcional de uma Fosfolipase A2 homóloga e peptídeos sintéticos do veneno de Lachesis muta muta com atividade antibacteriana
Authors: Sousa, Rafaela Diniz
Keywords: Veneno de serpentes
Lachesis muta muta
Fosfolipase A2 homóloga
Peptídeos sintéticos
Atividade antimicrobiana
Issue Date: 2018
Citation: SOUSA, R. D. Caracterização bioquímica e funcional de uma Fosfolipase A2 homóloga e peptídeos sintéticos do veneno de Lachesis muta muta com atividade antibacteriana. 85f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental da Fundação Federal de Rondônia, 2018.
Abstract: A luta pela sobrevivência em ambientes hostis selecionou, ao longo da evolução, organismos ou populações inteiras que conseguiram desenvolver ferramentas úteis de adaptação, como venenos, toxinas ou repelentes. Dentre estes, os venenos de serpentes se destacaram por suas atividades biológicas frente a vários patógenos, como bactérias, fungos e protozoários, mostrando-se fontes inestimáveis de novos agentes antimicrobianos. O objetivo desse estudo foi isolar e caracterizar bioquímica e funcionalmente fosfolipases A2 (PLA2) e peptídeos sintéticos do veneno da serpente Lachesis muta muta (VLmm) com possíveis atividades antimicrobianas. O VLmm foi fracionado em duas etapas cromatográficas. Na primeira, realizada em resina de exclusão molecular (Sephacryl S200), foram obtidas 4 frações, denominadas LmS-1 a LmS-4. Após eletroforese e avaliação da atividade fosfolipásica, observou-se que LmS-3 e LmS-4 apresentavam massas moleculares compatíveis com PLA2s, contudo mostraram-se desprovidas de atividades enzimáticas sobre o substrato ácido 4-nitro-3- octanoiloxi benzoico. Na segunda etapa, a fração LmS-3 foi cromatografada em coluna de fase reversa (C18), com a obtenção de 6 frações (P1 a P6), onde P6 continha uma proteína com características compatíveis com as de interesse. A determinação da massa molecular de P6 foi realizada por Espectrometria de Massa, onde se observou uma molécula com 13889 Da. A estrutura primária, determinada por Degradação de Edman e complementada por espectrometria de massa, evidenciou elevada identidade com PLA2s homólogas dos venenos de serpentes do gênero Bothrops. A proteína foi então nomeada LmutTX. Peptídeos sintéticos desenhados a partir da sequência primária de LmutTX (regiões N-terminal, segmento 41-52 e C-terminal) foram avaliados quanto às suas atividades citotóxicas e antimicrobianas, juntamente com a proteína íntegra. Na citotoxicidade sobre células musculares C2C12 diferenciadas em miotubos, o VLmm e LmutTX diminuíram a viabilidade celular em mais de 50% nas concentrações de 5 e 40 μg/poço, respectivamente, enquanto os peptídeos apresentaram baixo efeito citotóxico, não atingindo mais de 30% de dano na maior concentração testada (125 μg/poço). Nenhum dos peptídeos foram hemolíticos quando incubados em suspensões de eritrócitos. A avaliação do potencial antimicrobiano de LmutTX foi realizada em diferentes parasitas, como Trypanosoma cruzi clone CL-B5, Leishmania infantum MCAN/ES/92/BCN83 e Plasmodium falciparum cloroquina-resistente (W2), e bactérias, como Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus resistente a meticilina (MRSA), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e Escherichia coli ATCC 25922. A toxina não mostrou atividade sobre T. cruzi e L. infantum na concentração testada de 100 μg/mL, mas apresentou um IC50 de 105 μg/mL sobre P. ii falciparum. No ensaio de antibiofilme, LmutTX inibiu mais de 50% da formação de biofilme das cepas de S. aureus ATCC 25904 e S. epidermidis ATCC 35984 (100 μg/mL). A atividade de LmutTX sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas na concentração de 12,5 μg/mL foi suficiente para inibir ~60% do crescimento bacteriano nos períodos de 24 e 48 horas, exceto para E. coli que não foi inibida pela toxina. Peptídeos sintéticos de LmutTX foram avaliados sobre cepas de S. aureus, MRSA e P. aeruginosa, onde mostraram atividades relevantes para as duas últimas cepas. Um dos peptídeos derivados da região C-terminal foi capaz de inibir completamente o crescimento de MRSA na concentração de 15,6 μg/mL, demonstrando o grande potencial de peptídeos sintéticos derivados de proteínas. Este trabalho descreve pela primeira vez, o isolamento e a caracterização de uma PLA2 homóloga do veneno de L. m. muta com potencial antibacteriano sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas, bem como a identificação da região da molécula responsável por tal atividade.
Description: Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental da Universidade Federal de Rondônia - UNIR, para obtenção do grau de Doutora em Biologia Experimental. Orientador: Dr. Andreimar Martins Soares
URI: http://www.ri.unir.br/jspui/handle/123456789/2450
Appears in Collections:PGBIOEXP/PVH - Doutorado em Biologia Experimental (Teses)

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