Expressão e purificação da proteína Corismato Sintaxe de Plasmodium falciparum a partir da otimização e síntese do gene para sistema procariótico.

Abstract

A malária é uma doença de grande importância epidemiológica em termos de morbidade e mortalidade no mundo. O índice de resistência às drogas antimaláricas vem aumentando gradativamente ao longo das últimas décadas. A descrição de vias metabólicas exclusivas de Plasmodium está abrindo perspectivas para desenvolvimento de novas drogas contra alvos moleculares bem definidos. A via do chiquimato é uma dessas vias metabólicas, e nesta está presente a enzima corismato sintase (CS) que catalisa a transformação de 5- enolpiruvil chiquimato 3-fosfato em corismato, último precursor comum na biossíntese de compostos aromáticos, presentes em bactérias, fungos, plantas, protozoários apicomplexa e ausente em mamíferos. A síntese e otimização do gene da proteína (PfCS) foi necessária para expressão em sistema procarioto. O produto gênico liofilizado foi inserido em vetor de clonagem PUC57 e vetor de expressão pGS21a. O plasmídeo foi transformado em células competentes TOP 10 F’, em seguida realizou-se miniprep e confirmação com enzimas de restrição Ncol e SalI. A retransformação foi realizada em células competentes BL 21 DE3 pLys e a indução foi com IPTG. A expressão foi confirmada por gel de SDSPAGE. A etapa de purificação foi realizada com Kit Qiagen 6x Histidina em coluna de Ni-NTA. A expressão foi obtida na forma de proteína recombinante de fusão com histidina, assumindo a forma de corpúsculos de inclusão, que foram desnaturadas com uréia 8M. Após purificação por coluna de afinidade obtivemos um nível aceitável de pureza. Estamos trabalhando para expressar essa proteína na forma solúvel e também em protocolos de renovelamento. Estudos in vitro englobando teste da atividade e inibição enzimática utilizando extratos vegetais encontrados na região Amazônica poderão identificar novos potenciais de fármacos para o tratamento da malária, inicialmente P. falciparum.