DSpace Coleção:
https://ri.unir.br/jspui/handle/123456789/93
2024-03-28T23:36:55ZCruzaína de Trypanosoma cruzi: prospecção e identificação de inibidores com potencial atividade tripanocida
https://ri.unir.br/jspui/handle/123456789/3319
Título: Cruzaína de Trypanosoma cruzi: prospecção e identificação de inibidores com potencial atividade tripanocida
Autor(es): Díaz, Jorge Javier Alfonso Ruiz
Resumo: A Doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi é considerada pela Organização Mundial da Saúde como uma Doença Tropical Negligenciada, afetando aproximadamente sete milhões de indivíduos em todo o mundo, sendo a América Latina a região que apresenta maior número de casos.
Clinicamente, a DC apresenta-se como uma doença bifásica, onde a fase crônica é caracterizada pela reduzida eficácia da terapêutica farmacológica. Outras limitações estão relacionadas aos severos efeitos secundários, assim como os casos de resistência que têm sido relatados. Esta situação torna de vital importância o desenvolvimento de novas estratégias que visem a identificação de moléculas capazes de se tornarem alternativas ou complementação à quimioterapia atual. Neste contexto, o envolvimento da principal cisteíno protease de T. cruzi, a cruzaína, nos processos chaves do ciclo vital deste parasito, tais como proliferação, diferenciação e invasão celular, assim como na evasão do sistema imune do hospedeiro, torna esta protease um alvo molecular interessante para ser explorado. Considerando o
mencionado, o presente trabalho teve como objetivo a identificação de inibidores da cruzaína com potencial atividade tripanocida. Para tanto, inicialmente a cruzaína recombinante foi obtida mediante expressão heteróloga em sistema procarioto na forma de zimogênio e sequencialmente ativada por auto proteólise, resultando em uma proteína com massa molecular de aproximadamente 23 kDa. Posteriormente, na busca de potenciais inibidores da cruzaína, foi identificada na literatura uma cistatina
da peçonha de Austrelaps superbus (AsCystatin) com ação inibitória sobre a atividade catalítica de cisteíno proteases. Objetivando avaliar as interações in silico deste potencial inibidor com a cruzaína, obteve-se o modelo tridimensional por modelagem por homologia, seguida pela análise de interação por docking molecular, onde foi possível observar que regiões chaves para a atividade catalítica da cruzaína
interagem com a AsCystatin. Considerando estes resultados, optou-se por expressar a AsCystatin na sua forma recombinante em bactérias E. coli, obtendo-se a proteína com alto grau de pureza e massa molecular relativa de 13 kDa. Os ensaios seguiram com a avaliação da inibição da AsCystatin sobre a atividade da cruzaína (IAE50), observando-se que 21,2 µM de cistatina inibiu 50% da atividade catalítica da enzima Baseados nas análises in silico realizadas anteriormente, peptídeos originais e modificados foram desenhados e testados, o que permitiu a identificação de 4 peptídeos com capacidade para inibir a atividade enzimática da cruzaína. Por fim, três destes peptídeos mostraram em modelos in vitro, atividade tripanocida sobre formas epimastigotas de T. cruzi. Concluindo, neste trabalho foi possível a identificação da AsCystatin e de quatro peptídeos derivados desta proteína com atividade inibitória
sobre a cruzaína, ressaltando ainda o efeito citotóxico associado a estes peptídeos observados em ensaios in vitro sobre o T. cruzi.
Descrição: Tese de Doutorado apresentado ao de Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental (PGBIOEXP), na Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR), como requisito final para obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental. Orientador: Leonardo de Azevedo Calderon; Co-orientador: Andreimar M. Soares.2019-01-01T00:00:00ZIdentificação de um peptídeo derivado de uma metaloprotease de bothrops moojeni com ação inibitória in vitro sobre a enzima fosforilase de nucleosídeos purínicos de plasmodium falciparum (PfPNP)
https://ri.unir.br/jspui/handle/123456789/2973
Título: Identificação de um peptídeo derivado de uma metaloprotease de bothrops moojeni com ação inibitória in vitro sobre a enzima fosforilase de nucleosídeos purínicos de plasmodium falciparum (PfPNP)
Autor(es): Martins, Gracianny Gomes
Resumo: Observa-se a necessidade crescente na pesquisa de novos agentes antimaláricos
contra a infecção por Plasmodium falciparum, baseado principalmente no
planejamento racional de fármacos para alvos moleculares específicos no parasito, já
que o surgimento de resistência à maioria dos fármacos para o tratamento da malária
tem sido amplamente relatado. Diante disso, o objetivo geral deste estudo foi avaliar
a atividade de uma metaloprotease de Bothrops moojeni (BmooMPα-I) contra
Plasmodium falciparum in vitro e por meio de estudos in silico, mapear e identificar,
pela primeira vez, regiões peptídicas com potencial ação inibitória da enzima
fosforilase de nucleosídeos purínicos de P. falciparum (PfPNP), uma enzima
necessária para a sobrevida do parasito. Inicialmente isolou-se a BmooMPα-I por
cromatografia de troca catiônica e fase reversa, e em seguida foram executados
ensaios in vitro de atividade antiparasitária contra cepa P. falciparum W2. Para os
ensaios in silico, as interações entre a BmooMPα-I e a PfPNP foram avaliadas via
docking molecular e o peptídeo resultante, denominado de Pep 1 BM, foi selecionado
conforme a região da BmooMPα-I com melhor score de interação com o alvo de
interesse. Os valores para as atividades específicas da reação de PfPNP foram
aferidas utilizando o substrato fosfato inorgânico e MESG. A fração correspondente a
BmooMPα-I foi identificada como a fração 4 na etapa de cromatografia de troca
catiônica, devido a atividade proteolítica sobre a caseína e a presença de uma banda
principal de 23 kDa. BmooMPα-I foi capaz de inibir o crescimento in vitro de P.
falciparum W2, com valor de IC50 de 16,14 µg/mL. O virtual screening com o Pep1 BM
demonstrou duas regiões de ligação com o alvo PfPNP, com valores de ∆G na
interface de interação de -10,75 kcal/mol e -11,74 kcal/mol. A análise do alinhamento
múltiplo de sequências de metaloproteases de serpentes da classe PI com o peptídeo
Pep 1 BM, demonstrou que essa região não é conservada em outras espécies. Notouse uma redução significativa da atividade enzimática de PfPNP devido a presença de
Pep 1 BM, quando comparado ao ensaio de atividade in vitro desta enzima na
ausência deste possível inibidor. Ao avaliar a atividade antiparasitária in vitro do
peptídeo, observou-se um valor de IC50 ≥ 200 µg/mL, não apresentando uma atividade
significativa in vitro contra o P. falciparum W2. Mediante as técnicas in silico,
identificou-se o peptídeo Pep 1 BM com potencial afinidade de ligação ao sítio
catalítico de PfPNP e com capacidade de inibir sua atividade enzimática in vitro, sendo
necessário estudos posteriores de modificação molecular a fim de se propor
estratégias que favoreçam as características físico-químicas do peptídeo, como seu
perfil de hidro e lipossolubilidade, massa molecular e o coeficiente de ionização, a fim
de se obter um derivado capaz de reproduzir o efeito biológico inibitório sobre o alvo
PfPNP em experimentos in vitro contra o P. falciparum. Este estudo proporcionou
perspectivas para continuidade de ensaios da molécula Pep 1 BM, podendo ser
direcionado ao desenvolvimento de análogos biologicamente ativos que podem ter
suas atividades melhoradas através da deleção, adição e modificação racional da
sequência de aminoácidos, permitindo ampliar a diversidade molecular e aprimorar
propriedades farmacêuticas a fim de se propor novas terapias potenciais para o
tratamento da malária.
Descrição: Tese apresentada ao Programa de Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental (PGBIOEXP), na Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR), como requisito final para obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental. Orientador(a): Prof. Dr. Andreimar Martins Soares. Coorientador: Prof. Dr. Fernando Berton Zanchi.2019-01-01T00:00:00ZTripanotiona redutase de Leishmania braziliensis como alvo molecular para prospecção de novos inibidores: Avaliação da LAAO de Crotalus atrox com atividade antiparasitária
https://ri.unir.br/jspui/handle/123456789/2703
Título: Tripanotiona redutase de Leishmania braziliensis como alvo molecular para prospecção de novos inibidores: Avaliação da LAAO de Crotalus atrox com atividade antiparasitária
Autor(es): Garay, Ana Fidelina Gomez
Resumo: Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 1 milhão de
novos casos de Leishmaniose surgem anualmente. A quimioterapia baseia-se na
capacidade dos fármacos de interferir na sobrevivência do parasito apresentando
diversas limitações potencializando esta doença negligenciada como uma
problemática de saúde grave. Abordagens na busca por alternativas ao tratamento
utilizando alvos moleculares de Leishmania spp. estão sendo desenvolvidas por
diversos grupos de pesquisa. Entre estes alvos moleculares encontram-se as
enzimas implicadas em vias essenciais do parasito, como a tripanotiona redutase
(TR), envolvida no combate ao estresse oxidativo gerado pelas espécies reativas de
oxigênio produzidas por macrófagos do hospedeiro durante a infecção. Este trabalho
teve como objetivo investigar a TR de Leishmania braziliensis como alvo molecular
para prospecção de novos inibidores e posterior avaliação da LAAO de Crotalus
atrox com atividade antiparasitária. A proteína recombinante foi expressa em sua
forma ativa, homodimérica, com cada monômero apresentando massa molecular de
aproximadamente 54 kDa e ponto isoelétrico de 6,0. A análise da estrutura primária
da enzima expressa, revelou porcentagem elevada de identidade com as TR´s de
diversos tripanosomatídeos. Na prospecção realizada com elementos da
biodiversidade de venenos animais, com o intuito de identificar os potenciais
inibidores, avaliou-se a capacidade inibitória da fração L-aminoácido oxidase (LAAO)
da peçonha de Crotalus atrox contra o alvo molecular recombinante (IC50:119
μg/mL). Posteriormente, avaliou-se a atividade leishmanicida in vitro contra formas
promastigotas de L. amazonensis (IC50: 1,8 μg/mL) e L. braziliensis (IC50: 1,3 μg/mL)
e sequencialmente, foi determinada a CC50 sobre células THP1 (291,38 μg/mL);
J774.A1 (24,16 μg/mL); HepG2 (4,05 μg/mL) e VERO (1,95 μg/mL). Realizou-se a
modelagem molecular por homologia da LAAO e da TRLb, o docking molecular entre
as duas proteínas e o virtual screening entre os peptídeos derivados da estrutura
primária da LAAO com a enzima do parasito. Os estudos in silico permitiram a
identificação e síntese de 5 peptídeos os quais interagiram em regiões chaves da
enzima. Adicionalmente, foram testados 2 peptídeos com atividade microbicida para
avaliação do potencial inibitório da TR. Neste estudo, demonstrou-se o potencial
leishmanicida da fração LAAO da peçonha de C. atrox e a identificação do peptídeo
353RFIYY357, o qual apresenta atividade inibitória in vitro contra a TR (IC50: 287,5
μM). Os resultados promissores obtidos neste trabalho sugerem pesquisas
posteriores que visem avaliar o potencial leishmanicida do peptídeo e propor
estruturas derivadas deste inibidor com capacidade de acrescentar o efeito
antiparasitário.
Descrição: Tese apresentada ao Programa de Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental (PGBIOEXP), na Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR), como requisito final para obtenção do título de Doutora em Biologia Experimental. Orientador(a): Prof. Dr. Andreimar Martins Soares.2018-01-01T00:00:00ZInibidor de fosfolipase A2 tipo gama da serpente Bothrops atrox (atPLI): estudos on silico e in vitro de peptídeos sintéticos e análise de sistemas de expressão heteróloga do atPLI
https://ri.unir.br/jspui/handle/123456789/2611
Título: Inibidor de fosfolipase A2 tipo gama da serpente Bothrops atrox (atPLI): estudos on silico e in vitro de peptídeos sintéticos e análise de sistemas de expressão heteróloga do atPLI
Autor(es): Conceição Sobrinho, Juliana
Resumo: Importante contribuição aos sinais observados após o envenenamento ofídico são
desencadeados por fosfolipases A2 (PLA2s) contidas na peçonha de serpentes. Em
virtude disso, diversas são as pesquisas que objetivam identificar moléculas que
inibam as ações tóxicas dessas proteínas. Nessa linha de pesquisa, há os inibidores
de PLA2s (PLIs) encontrados no soro de serpentes, capazes de promover a
autoproteção e a proteção contra peçonhas de outras espécies de serpentes. A partir
do PLIγ da serpente B. atrox (atPLIγ), o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial
inibitório das atividades fosfolipásica e miotóxica in vitro de sete peptídeos
virtualmente selecionados, além da avaliação do decapeptídeo derivado da região 107
até 116 do atPLIγ (Ba-dec) e comparação dos resultados destes com o decapeptídeo
P.PB-III, derivado da mesma região no PLIγ da serpente P. reticulatus. Ademais,
explorar métodos de expressão heteróloga para a produção do atPLIγ recombinante.
Um banco de peptídeos contendo segmentos de 4 a 9 aminoácidos foi construído
utilizando a estrutura primária do atPLIγ. Os peptídeos foram submetidos a docking
molecular com a BATXPLA2, uma PLA2 homóloga Lys49 de B. atrox que teve sua
estrutura terciária gerada por modelagem por homologia no presente trabalho. No
docking molecular, os peptídeos selecionados interagiram em regiões que podem ser
críticas para a PLA2, como o canal hidrofóbico. A energia de ligação dos peptídeos
selecionados variou de -8,3 kcal/mol a -9,6 kcal/mol, indicando boa interação entre as
moléculas. No ensaio de neutralização da atividade fosfolipásica, exceto por um dos
sete peptídeos selecionados, todos os outros foram capazes de reduzir esta atividade
de forma significante, destacando-se os peptídeos DFCHNV e ATHEE que reduziram
a atividade em 50,0%. O peptídeo Ba-dec não reduziu a atividade fosfolipásica,
diferentemente do peptídeo P.PB-III que reduziu em 15,6% esta atividade. O peptídeo
DFCHNV alcançou o maior percentual de neutralização da atividade miotóxica,
reduzindo em 65% esta atividade e os outros peptídeos, com exceção de um,
reduziram a miotoxicidade entre 42,0 e 59,3%. O peptídeo P.PB-III reduziu a
citotoxicidade em 58,0%, porém o peptídeo Ba-dec não teve resultado significativo
para esta atividade, indicando que a modificação de dois resíduos de aminoácidos na
sequência pode ser importante para a manutenção do efeito inibidor. A expressão do
PLIγ foi explorada em dois sistemas de expressão diferentes e em diferentes vetores
plasmidiais, porém não foi detectada a produção da proteína. Contudo, a seleção
virtual de peptídeos a partir da sequência do atPLIγ demonstrou-se eficiente, visto que
a maioria dos peptídeos selecionados neutralizaram as atividades fosfolipásica e
miotóxica in vitro. Os PLIs são capazes de neutralizar as atividades tóxicas de PLA2s
e podem fornecer modelos estruturais promissores para o desenho de drogas
antiofídicas aplicáveis como suplementos da soroterapia convencional.
Descrição: Tese apresentada ao Programa de Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental (PGBIOEXP), na Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR), como requisito final para obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental. Orientador(a): Prof. Dr. Andreimar Martins Soares.2018-01-01T00:00:00Z