Micropartículas funcionalizadas com toxinas isoladas de Crotalus durissus terrificus como terapia experimental na leishaniose cutânea

Abstract

As leishmanioses encontram-se entre as doenças infectoparasitárias de maior incidência no mundo. Causada por protozoários do gênero Leishmania spp., essa doença acomete mais de 12 milhões de pessoas em 88 países, com cerca de 350 milhões sob o risco de adoecer. As drogas disponíveis para o tratamento da leishmaniose apresentam elevada toxicidade e nenhuma delas é suficientemente eficaz. Vários trabalhos têm descrito venenos de serpentes, bem como, suas toxinas como compostos com potencial atividade antiparasitária. Neste contexto, a produção de protótipos de fármacos abordando a micro ou nanotecnologia é uma alternativa promissora, visto que diferentes moléculas podem ser direcionadas para a célula alvo contendo o protozoário. O objetivo desse trabalho foi encapsular toxinas isoladas de Crotalus durissus terrificus em micropartículas poliméricas biodegradáveis, constituídas pelo Ácido Poli Lático co-Glicólico (PLGA) e avaliar sua atividade in vitro contra Leishmanina amazonensis. Análises de interação molecular entre as proteínas de L. amazonensis e as toxinas crotamina e crotoxina foram realizadas por Ressonância Plasmônica de Superfície (RPS). As micropartículas produzidas foram caracterizadas in vitro, através da análise dos diâmetros, Potencial Zeta, taxa de encapsulação e morfologia. A viabilidade das promastigotas expostas às toxinas encapsuladas e em solução foi avaliada através do ensaio colorimétrico de MTT. O ensaio de toxicidade de macrófagos murinos incubados com as micropartículas foi realizado pelo método colorimétrico de MTT. Além disso, foi determinado o índice fagocítico de macrófagos peritoneais incubados com micropartículas e o sobrenadante celular foi coletado para dosagem da citocina TNF-α. Também foi realizado um ensaio de infecção in vitro de macrófagos peritoneais com promastigotas de L. amazonensis. Os resultados de interação mostraram que a crotamina apresentou uma elevada afinidade e/ou interação com as proteínas presentes no extrato bruto de leishmania. Os diâmetros e potencial zeta das partículas controle e contendo crotamina foram (1,3 μm e -12,3 mV) e (3,0 μm e - 20,9 mV), respectivamente. As micropartículas contendo crotamina apresentaram efeitos similares (em torno de 18% de inibição) contra as formas promastigotas de L. amazonensis, após 24 e 48 horas de incubação. As partículas controle e contendo crotamina apresentaram toxicidade inferior a 5% em macrófagos peritoneais. O ensaio de fagocitose de micropartículas por macrófagos peritoneais mostrou que a quantidade de micropartículas contendo crotamina que foram capturadas foi superior a de micropartículas controle. Os maiores níveis de TNF-α detectados foram obtidos quando os macrófagos foram incubados com micropartículas contendo crotamina e também crotamina em solução. Macrófagos que capturaram micropartículas contendo crotamina apresentaram menor Índice Fagocítico quando comparados com os macrófagos apenas infectados. A aplicação desta tecnologia no modelo de infecção in vitro por L. amazonensis, envolvendo a liberação intracelular de uma toxina revelou-se segura e inovadora para o desenvolvimento de terapias alternativas/complementares contra a leishmaniose cutânea.