Utilização de PCR em tempo real para desenvolvimento de método qualitativo e quantitativo do vírus da hepatite B, em soro de pacientes crônicos no estado de Rondônia

Abstract

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), dois bilhões de pessoas já foram infectadas pelo vírus da hepatite B (HBV) e destes 400 milhões se tornaram portadores crônicos. A quantificação deste virus é amplamente utilizada para o monitoramento do tratamento antiviral da infecção. Um sistema de quantificação da carga viral do HBV foi desenvolvido, através da metodologia de PCR em tempo real, utilizando o sistema TaqMan. Como alvo um produto de 109 pb correspondente a região pré-core foi clonado e diluido seriadamente para construção da curva padrão. O método foi validado pela comparação dos resultados de quantificação da PCR em tempo real de sete amostras, com os resultados do Centro de Genomas, onde houve uma correlação significativa (r = 0,95) entre os dois métodos. O ensaio mostrou ampla faixa dinâmica linear entre 2x10² e 2×10⁷ cópias/ml. Amostras negativas para HBV foram utilizadas como controle nas reações, indicando a alta especificidade do ensaio. Os coeficientes de variação dos ensaios intra e interexperimental foram de 1% para ambas, os quais indicaram reprodutibilidade notável. O ensaio padronizado é aplicado a todos os genótipos, porém um número maior de amostras devem ser comparadas para melhor validação do método. Esse ensaio pode ser aplicado no monitoramento de pacientes infectados pelo HBV na rotina de diagnostico dos laboratórios e na prática clínica. Além disso, o estudo possibilitou a identificação da distribuição dos genótipos do HBV em 35 amostras de pacientes HBsAg-positivos. Um fragmento de 1306bp que corresponde parcialmente aos genes de superfície e da polimerase foi amplificado purificado e seqüenciado. As seqüências foram alinhadas com seqüências referência obtidas no GenBank usando software Clustal X e, em seguida, editadas com software SE-AL. As análises filogenéticas foram conduzidas pela Cadeia de Markov Monte Carlo (MCMC) usando BEASTv.1.5.3. A distribuição dos subgenótipos foi A1 (37,1%), D3 (22,8%), F2a(20,0%), D4 (17,1%) e D2 (2,8%). Esses resultados representam a primeira caracterização genotípica do HBV no estado de Rondônia e são consistentes com outros estudos no Brasil, mostrando a presença de vários genótipos, refletindo a origem mista da população, envolvendo descendentes de nativos americanos, europeus e africanos.