Análise molecular do vírus da hepatite Delta: desenvolvimento de transcrição reversaPCR em tempo real e nested PCR-RFLP para quantificação e genotipagem viral

Abstract

O vírus da hepatite Delta (HDV) é um patógeno que causa um infecção grave e rapidamente progressiva nos pacientes portadores. A determinação da quantidade e do genótipo do vírus circulante no sangue de pacientes com a infecção pelo HDV é importante para o diagnóstico, monitoramento do tratamento e para oferecer suporte para estudos de acompanhamento da replicação viral no curso da doença. Neste estudo desenvolvemos in house um ensaio capaz de detectar e quantificar o vírus da hepatite Delta através de amostras de soro baseando-se em uma Transcrição reversa–PCR em tempo real quantitativa (HDV RT-qPCR) e uma nested PCR-RFLP para a genotipagem do HDV. Para a determinação da carga viral foram produzidos dois calibradores padrão, um cDNA HDV clonado em plasmídeo e um transcrito de RNA HDV. Para a validação este ensaio foram utilizadas 140 amostras clínicas de soro, sendo 100 amostras clínicas de pacientes anti-HDV e antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) reagentes por ELISA, 30 amostras clínicas de doadores de sangue, 5 amostras clínicas monoinfectadas pelo vírus da hepatite B (HBV) e 5 amostras monoinfectadas pelo vírus da hepatite C (HCV). Para genotipagem foi estabelecida uma nested PCR-RFLP, utilizando Xho l e a Sma l para digerir os amplicons, os resultados corroboraram com as análises por sequenciamento. O desempenho do ensaio HDV RTqPCR foi melhor quando utilizado o calibrador padrão HDV baseado em cDNA clonado em plasmídeo linear com uma eficiência de 99,8% e linearidade de R2 0,97 e uma especificidade de 100% nos ensaios in vitro. Este estudo representa o primeiro ensaio HDV RT-qPCR desenvolvido com amostras clínicas do Brasil e oferece um grande potencial para novos estudos de eficácia clínica da terapêutica antiviral para utilização em pacientes com hepatite Delta na região ocidental da Amazônia.