Isolamento e caracterização bioquímica e estrutural de fosfolipases a2 ácidas do veneno da serpente Bothrops brazili

Abstract

A serpente Bothrops brazili está distribuída por toda a região amazônica e seu veneno, como nas demais serpentes deste gênero, é rico em proteínas e peptídeos bioativos. As fosfolipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) são importantes enzimas presentes no veneno de serpentes e estão relacionadas a um amplo espectro de efeitos farmacológicos tais como inflamação aguda, miotoxicidade e nocicepção. O presente trabalho teve como objetivo efetuar o isolamento e a caracterização bioquímica e estrutural de duas novas PLA2s ácidas do veneno de B. brazili, denominadas de Braziliase-I e Braziliase-II. Para tanto, o veneno foi fracionado em três etapas cromatográficas que se mostraram eficientes na purificação: troca iônica, interação hidrofóbica e fase reversa. A homogeneidade e pureza das proteínas foram avaliadas por SDS-PAGE, onde se observou a presença de uma única banda de aproximadamente 14 kDa. As massas moleculares foram determinadas por espectrometria com valores de 13.894,38 Da para Braziliase-I e 13.869,63 Da para Braziliase-II. As estruturas primárias das duas PLA2s foram determinadas, podendo-se verificar que se tratam de PLA2s da classe Asp49, sendo observada uma elevada identidade com PLA2s ácidas isoladas do veneno de outras serpentes. A atividade enzimática foi avaliada utilizando-se o substrato fluorescente NBD-PC e demonstrou que ambas possuem maior atividade entre pHs de 6,8 a 11 e que perdem atividade na temperatura de 80ºC e na presença de EDTA. A modelagem molecular das Braziliase-I e II foi feita utilizando-se a PLA2 CB (3R0L) de Crotalus durissus terrificus como modelo. A dinâmica molecular realizada mostrou elevada qualidade no modelo gerado e também fez melhorias em ambos os modelos. Dos resíduos encontrados em regiões desfavoráveis (gráfico de Ramachandran), os mesmos estavam localizados em regiões de elevada flexibilidade. O modelo final foi capaz de adquirir a conformação típica de uma PLA2 de veneno de serpente. A atividade edematogênica foi realizada em modelo murino com ambas as PLA2s (Braziliase-I e Braziliase-II) que mostraram ser capazes de promover edema, induzindo um aumento de 27,6% e 22,8% nos primeiros 30 minutos e regredindo logo após. A atividade miotóxica foi avaliada para Braziliase-I e II que demonstraram não serem miotoxinas. Por meio de ensaio de agregação plaquetária detectou-se que ambas as PLA2s isoladas indicaram apresentar atividade antiplaquetária sobre a agregação induzida por ADP e a Braziliase-II sobre a agregação induzida por colágeno também. Por fim, o isolamento e a caracterização das PLA2s constituem etapas fundamentais para o estudo da função dessas proteínas na fisiopatologia do envenenamento e na viabilidade destas enzimas como alvos potenciais para pesquisa de novos fármacos de ação antibacteriana, antiplasmodial, antifúngica, antiplaquetária, antitumoral entre outras.