Anticorpos de domínio único, do tipo VHH, contra crotoxina do veneno de Crotalus durissus terreficus: ferramentas biotecnológicas para o diagnóstico ou tratamento do envenenamento crotálico

Abstract

A soroterapia, tratamento recomendado nos casos de envenenamentos causados por animais peçonhentos, consiste na administração de imunobiológicos derivados de animais hiperimunizados. Apesar de efetivos para a neutralização sistêmica de toxinas, os soroterápicos, compostos por IgG ou fragmentos Fab ou F(ab’)2, apresentam limitações relacionadas ao alto custo de produção, baixa eficácia na neutralização de toxinas em tecidos profundos e frequentes reações adversas. Para superar essas limitações, a utilização de anticorpos monoclonais (mAbs) e fragmentos (Fab, F(ab’)2 e scFv) engenheirados por biologia molecular vem sendo proposta. Entretanto, desvantagens relacionadas ao custo de produção, perfil de biodistribuição anticorpos/toxinas e o aparecimento de respostas imunes aos mAbs, além do elevado clearance renal, baixa estabilidade, solubilidade e afinidade de seus fragmentos, persistem. Nesse cenário, os fragmentos de anticorpos de cadeia pesada de camelídeos (sdAbs, VHH ou nanocorpo) aparecem como alternativa. Esses insumos apresentam reduzido tamanho (2,5 x 4,0 nm) e baixa massa molecular (15 kDa), estabilidade a variações de pH e temperatura, elevada especificidade e afinidade antigênica, baixa imunogenicidade, podem ser produzidos em microorganismos e usados como blocos modulares para obtenção de diferentes construtos de anticorpos. Entre os acidentes com serpentes peçonhentas no Brasil, o gênero Crotalus é responsável por 7-11% dos casos, com taxa de mortalidade de até 4,7%. Os efeitos neurotóxicos, miotóxicos e nefrotóxicos ocasionados pelo envenenamento crotálico estão principalmente relacionados à crotoxina, formada por uma fosfolipase A2 básica, enzimaticamente ativa, (CB, crotoxina-B, PLA2-CB) e uma subunidade ácida, enzimaticamente inativa, (CA, crotoxina-A, Crotapotina). Considerando as potencialidades dos sdAbs de camelídeos e a necessidade de ferramentas auxiliares a soroterapia convencional, este trabalho teve como objetivo caracterizar in silico e in vitro anticorpos de domínio único, do tipo VHH, derivados de anticorpos de cadeia pesada de Lama glama, ativos contra crotoxina obtida do veneno de Crotalus durissus terrificus e verificar a capacidade neutralizante do efeito miotóxico ocasionado por essa toxina in vivo. Após padronização da expressão em E.coli BL21(DE3), ensaios de imunorreatividade em ELISA demonstraram a especificidade dos VHHs à PLA2-CB, livre e conjugada à crotapotina. Esses resultados foram confirmados por Western blot. Estudos para avaliar a termoestabilidade clonal indicaram funcionalidade dos clones mesmo após aquecimento a 56ºC. As constantes de afinidade dos clones KF498602 (KD=1,7 μM) e KF498604 (KD= 81,3 nM) foram determinadas por Ressonância Plasmônica de Superfície (RPS). Esses ensaios indicaram ainda que os clones reconhecem diferentes epítopos da crotoxina. O VHH KF498604 foi capaz de inibir a atividade fosfolipásica in vitro da crotoxina e PLA2-CB em até 80%, a atividade citotóxica da PLA2-CB sobre miotubos murinos em 59,3% e miotoxicidade desencadeada por crotoxina in vivo em até 78,8%. O modelo molecular de interação, proposto por Docking, sugere que a expressiva capacidade inibitória do clone KF498604 se deve ao bloqueio estérico do sítio catalítico da PLA2-CB no heterodímero crotoxina. Observando o envolvimento da crotoxina no desencadeamento insuficiência renal aguda (IRA), a causa mais comum de morte no envenenamento crotálico, os desafios da soroterapia, as vantagens dos VHHs e a elevada capacidade inibitória do clone KF498604, consideramos os clones selecionados ferramentas promissoras para o diagnóstico e tratamento do envenenamento crotálico.