Desenvolvimento de marcadores de DNA de genes das isoenzimas para uso em análise genética de Leishmania spp

Abstract

A leishmaniose é uma doença infecciosa causada por parasitas do gênero Leishmania spp.. A doença tem impacto mundial, com taxas de morbidade e mortalidade consideráveis, especialmente nos países em desenvolvimento, encontrando-se em franca expansão no mundo e acomete milhões de pessoas anualmente, atingindo 98 países de regiões tropicais e subtropicais, representando um importante problema de Saúde Pública. O gênero Leishmania é constituído por cerca de 30 espécies, distribuídas em regiões de clima tropical e subtropical de todo o mundo, exceto Oceania, incluindo 22 espécies patogênicas aos humanos que são responsáveis pelas três manifestações clínicas mais comuns da doença. Em regiões endêmicas, o diagnóstico laboratorial sorológico é empregado, porém, outras técnicas parasitológicas e/ou moleculares têm alta sensibilidade para identificação do gênero Leishmania. O aumento de dados de genomas de Leishmania proporciona um maior conhecimento de regiões e marcadores para identificação de espécies do protozoário e variações intra-específicas. Apesar disso, espécies ainda tem sido subdiagnosticadas. Não obstante, com o avanço tecnológico e maior conhecimento da biologia do parasito, a diferenciação das espécies de Leishmania em amostras clínicas ainda apresenta limitações. O objetivo central deste trabalho foi desenvolver marcadores genéticos de isolados de Leishmania braziliensis, Leishmania amazonensis e L. guyanensis por meio de técnicas moleculares, a partir na análise principal em 12 genes de isoenzimas em ensaio in silico. Foi realizada a identificação e caracterização das espécies de Leishmania spp utilizando iniciadores da região HSP70, identificação do LRV, perfil de isoenzimas (MLEE) e sequenciamento genômico dos isolados, provenientes de amostras coletadas de pacientes no estado de Rondônia. Utilizando-se a base de dados disponível no banco genômico NCBI e TriTrypDB, foram utilizados 10 genomas de referência das 12 espécies analisadas e usados em parte das análises. Os dados dos sequenciamentos geraram três rascunhos genômicos. A análise primária foi realizada pelo software Ion reporter, demonstrando carregamento de 45 a 66% dos chips contendo ISPs (Ion Sphere Particles), gerando de 579 a 924 Mb de dados. Os dados do sequenciamento foram mapeados contra genomas de referências de L. braziliensis, L.guyanensis (este resultante do primeiro sequenciamento) e L. amazonensis (MHOMBR71973M2269), resultando um total de até 887 Mb alinhadas, que corresponde a 96% das bases e cobertura de 27,7 vezes do genoma. O presente estudo permitiu a obtenção de informações genômicas das três espécies, assim como o número de genes preditos (8873, 8356 e 7574, respectivamente). Foram obtidas 196 sequências proteicas com similaridade as isoenzimas, resultante do alinhamento local via ferramenta CLC Genomics Workbank com plugin ao BLAST/NCBI e UniProtKB, das 12 espécies (Leishmania (L. amazonensis, L. braziliensis, L. guyanensis, L. lainsoni, L. lindembergi, L. major, L. mexicana, L. naiffi, L. panamensis, L. peruviana, L. shawi, L. utigensis) analisadas, e a partir dos dados genômicos analisados.