Inibidor de fosfolipase A2 tipo gama da serpente Bothrops atrox (atPLI): estudos on silico e in vitro de peptídeos sintéticos e análise de sistemas de expressão heteróloga do atPLI

Abstract

Importante contribuição aos sinais observados após o envenenamento ofídico são desencadeados por fosfolipases A2 (PLA2s) contidas na peçonha de serpentes. Em virtude disso, diversas são as pesquisas que objetivam identificar moléculas que inibam as ações tóxicas dessas proteínas. Nessa linha de pesquisa, há os inibidores de PLA2s (PLIs) encontrados no soro de serpentes, capazes de promover a autoproteção e a proteção contra peçonhas de outras espécies de serpentes. A partir do PLIγ da serpente B. atrox (atPLIγ), o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial inibitório das atividades fosfolipásica e miotóxica in vitro de sete peptídeos virtualmente selecionados, além da avaliação do decapeptídeo derivado da região 107 até 116 do atPLIγ (Ba-dec) e comparação dos resultados destes com o decapeptídeo P.PB-III, derivado da mesma região no PLIγ da serpente P. reticulatus. Ademais, explorar métodos de expressão heteróloga para a produção do atPLIγ recombinante. Um banco de peptídeos contendo segmentos de 4 a 9 aminoácidos foi construído utilizando a estrutura primária do atPLIγ. Os peptídeos foram submetidos a docking molecular com a BATXPLA2, uma PLA2 homóloga Lys49 de B. atrox que teve sua estrutura terciária gerada por modelagem por homologia no presente trabalho. No docking molecular, os peptídeos selecionados interagiram em regiões que podem ser críticas para a PLA2, como o canal hidrofóbico. A energia de ligação dos peptídeos selecionados variou de -8,3 kcal/mol a -9,6 kcal/mol, indicando boa interação entre as moléculas. No ensaio de neutralização da atividade fosfolipásica, exceto por um dos sete peptídeos selecionados, todos os outros foram capazes de reduzir esta atividade de forma significante, destacando-se os peptídeos DFCHNV e ATHEE que reduziram a atividade em 50,0%. O peptídeo Ba-dec não reduziu a atividade fosfolipásica, diferentemente do peptídeo P.PB-III que reduziu em 15,6% esta atividade. O peptídeo DFCHNV alcançou o maior percentual de neutralização da atividade miotóxica, reduzindo em 65% esta atividade e os outros peptídeos, com exceção de um, reduziram a miotoxicidade entre 42,0 e 59,3%. O peptídeo P.PB-III reduziu a citotoxicidade em 58,0%, porém o peptídeo Ba-dec não teve resultado significativo para esta atividade, indicando que a modificação de dois resíduos de aminoácidos na sequência pode ser importante para a manutenção do efeito inibidor. A expressão do PLIγ foi explorada em dois sistemas de expressão diferentes e em diferentes vetores plasmidiais, porém não foi detectada a produção da proteína. Contudo, a seleção virtual de peptídeos a partir da sequência do atPLIγ demonstrou-se eficiente, visto que a maioria dos peptídeos selecionados neutralizaram as atividades fosfolipásica e miotóxica in vitro. Os PLIs são capazes de neutralizar as atividades tóxicas de PLA2s e podem fornecer modelos estruturais promissores para o desenho de drogas antiofídicas aplicáveis como suplementos da soroterapia convencional.