Identificação de um peptídeo derivado de uma metaloprotease de bothrops moojeni com ação inibitória in vitro sobre a enzima fosforilase de nucleosídeos purínicos de plasmodium falciparum (PfPNP)

Abstract

Observa-se a necessidade crescente na pesquisa de novos agentes antimaláricos contra a infecção por Plasmodium falciparum, baseado principalmente no planejamento racional de fármacos para alvos moleculares específicos no parasito, já que o surgimento de resistência à maioria dos fármacos para o tratamento da malária tem sido amplamente relatado. Diante disso, o objetivo geral deste estudo foi avaliar a atividade de uma metaloprotease de Bothrops moojeni (BmooMPα-I) contra Plasmodium falciparum in vitro e por meio de estudos in silico, mapear e identificar, pela primeira vez, regiões peptídicas com potencial ação inibitória da enzima fosforilase de nucleosídeos purínicos de P. falciparum (PfPNP), uma enzima necessária para a sobrevida do parasito. Inicialmente isolou-se a BmooMPα-I por cromatografia de troca catiônica e fase reversa, e em seguida foram executados ensaios in vitro de atividade antiparasitária contra cepa P. falciparum W2. Para os ensaios in silico, as interações entre a BmooMPα-I e a PfPNP foram avaliadas via docking molecular e o peptídeo resultante, denominado de Pep 1 BM, foi selecionado conforme a região da BmooMPα-I com melhor score de interação com o alvo de interesse. Os valores para as atividades específicas da reação de PfPNP foram aferidas utilizando o substrato fosfato inorgânico e MESG. A fração correspondente a BmooMPα-I foi identificada como a fração 4 na etapa de cromatografia de troca catiônica, devido a atividade proteolítica sobre a caseína e a presença de uma banda principal de 23 kDa. BmooMPα-I foi capaz de inibir o crescimento in vitro de P. falciparum W2, com valor de IC50 de 16,14 µg/mL. O virtual screening com o Pep1 BM demonstrou duas regiões de ligação com o alvo PfPNP, com valores de ∆G na interface de interação de -10,75 kcal/mol e -11,74 kcal/mol. A análise do alinhamento múltiplo de sequências de metaloproteases de serpentes da classe PI com o peptídeo Pep 1 BM, demonstrou que essa região não é conservada em outras espécies. Notouse uma redução significativa da atividade enzimática de PfPNP devido a presença de Pep 1 BM, quando comparado ao ensaio de atividade in vitro desta enzima na ausência deste possível inibidor. Ao avaliar a atividade antiparasitária in vitro do peptídeo, observou-se um valor de IC50 ≥ 200 µg/mL, não apresentando uma atividade significativa in vitro contra o P. falciparum W2. Mediante as técnicas in silico, identificou-se o peptídeo Pep 1 BM com potencial afinidade de ligação ao sítio catalítico de PfPNP e com capacidade de inibir sua atividade enzimática in vitro, sendo necessário estudos posteriores de modificação molecular a fim de se propor estratégias que favoreçam as características físico-químicas do peptídeo, como seu perfil de hidro e lipossolubilidade, massa molecular e o coeficiente de ionização, a fim de se obter um derivado capaz de reproduzir o efeito biológico inibitório sobre o alvo PfPNP em experimentos in vitro contra o P. falciparum. Este estudo proporcionou perspectivas para continuidade de ensaios da molécula Pep 1 BM, podendo ser direcionado ao desenvolvimento de análogos biologicamente ativos que podem ter suas atividades melhoradas através da deleção, adição e modificação racional da sequência de aminoácidos, permitindo ampliar a diversidade molecular e aprimorar propriedades farmacêuticas a fim de se propor novas terapias potenciais para o tratamento da malária.