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Título: Padronização e avaliação de um protocolo para extração de dna em papel de filtro utilizando amostras de plasmodium spp
Autor(es): Saraiva, Maria José de Souza
Palavras-chave: Extração de DNA
Malária
Papel de filtro
Diagnóstico
Data do documento: 2019
Citação: SARAIVA, M. J. de S. Padronização e avaliação de um protocolo para extração de DNA em papel de filtro utilizando amostras de plasmodium spp). 2019. 89f. Dissertação (Mestrado em Biologia Experimental) - Programa de Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental (PGBIOEXP), Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR), Porto Velho, 2019.
Resumo: O preparo rápido de amostras e a simplificação da extração de DNA é um dos desafios para os diagnósticos moleculares da malária em áreas com pouca estrutura. As técnicas convencionais de extração exigem condições especiais para o seu preparo, várias etapas de manipulação, além de elevar o custo da realização do procedimento. O IBMP (Instituto de Biologia Molecular do Paraná) desenvolveu um kit de extração de DNA para tuberculose, com otimização das etapas utilizadas durante a extração convencional por meio da redução da utilização de reagentes e retiradas dos processos de lavagem, além de não necessitar de inclusão de álcool para os processos de purificação, permitindo uma resposta rápida e eficiente, além de oferecer um custo benefício acessível e também viabilizar a reprodução da técnica em qualquer ambiente. O objetivo desse estudo foi adaptar o kit de extração do IBMP, utilizado no diagnóstico de tuberculose, para extração de DNA de Plasmodium spp. Trata-se de uma técnica de extração in house e inclui o uso de amostras de sangue total armazenadas em papel de filtro impregnado com detergentes, que causam a lise das membranas celulares por desnaturação proteica, expondo o DNA do parasito, ao mesmo tempo em que ocorre a estabilização dos ácidos nucleicos, facilitando o armazenamento em temperatura ambiente e impedindo o crescimento de microrganismos. A técnica utiliza um agente caotrópico que vem em substituição ao tampão de lise dos kits de extração convencional. Esta nova técnica poderá facilitar a coleta e transporte de amostras em regiões de difícil acesso ou com pouco estrutura disponível, permitindo a extração de DNA em etapa única. Incialmente foram utilizadas amostras de DNA extraídos de P. falciparum, visando a padronização da curva para detecção linear de parasitos por microlitro. Diluições de Log10 (10.000/1.000/100/10 e 1 parasitas / µL) foram utilizadas para confecção da curva de regressão linear. Os resultados mostram um limite de detecção (LOD) de até 1 parasitas/µL. Para validação da técnica foram utilizadas 30 amostras de indivíduos atendidos pelo laboratório de referência no diagnóstico da malária (Cepem/Porto Velho), sendo 25 (83,33%) positivas para malária e 5 (16,66%) negativas, segundo a Microscopia óptica. A comparação entre as duas técnicas de extração (IBMP e Qiagen) demonstrou valor de Kappa 1,00 para ambas as espécies parasitárias (falciparum e vivax), indicando forte concordância entre os resultados, além de demostrar 100% de sensibilidade e especificidade com a extração Qiagen e Microscopia óptica. Os testes utilizando o protocolo do IBMP demostraram uma sensibilidade tão eficiente quanto a realizada com o kit Qiagen, demonstrando a viabilidade da reprodução da técnica aqui apresentada. Os resultados deste estudo servirão como validação de um novo Kit de extração rápida de DNA para registro na Agência de Vigilância Sanitária.
Descrição: Dissertação apresentada ao Programa de Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental (PGBIOEXP), na Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR), como requisito final para obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental. Orientador(a): Prof. Dr. Dhélio Batista Pereira. Coorientadora: Profª. Dra. Giselle Martins Gonçalves.
URI: http://ri.unir.br/jspui/handle/123456789/2974
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