Cruzaína de Trypanosoma cruzi: prospecção e identificação de inibidores com potencial atividade tripanocida

Abstract

A Doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi é considerada pela Organização Mundial da Saúde como uma Doença Tropical Negligenciada, afetando aproximadamente sete milhões de indivíduos em todo o mundo, sendo a América Latina a região que apresenta maior número de casos. Clinicamente, a DC apresenta-se como uma doença bifásica, onde a fase crônica é caracterizada pela reduzida eficácia da terapêutica farmacológica. Outras limitações estão relacionadas aos severos efeitos secundários, assim como os casos de resistência que têm sido relatados. Esta situação torna de vital importância o desenvolvimento de novas estratégias que visem a identificação de moléculas capazes de se tornarem alternativas ou complementação à quimioterapia atual. Neste contexto, o envolvimento da principal cisteíno protease de T. cruzi, a cruzaína, nos processos chaves do ciclo vital deste parasito, tais como proliferação, diferenciação e invasão celular, assim como na evasão do sistema imune do hospedeiro, torna esta protease um alvo molecular interessante para ser explorado. Considerando o mencionado, o presente trabalho teve como objetivo a identificação de inibidores da cruzaína com potencial atividade tripanocida. Para tanto, inicialmente a cruzaína recombinante foi obtida mediante expressão heteróloga em sistema procarioto na forma de zimogênio e sequencialmente ativada por auto proteólise, resultando em uma proteína com massa molecular de aproximadamente 23 kDa. Posteriormente, na busca de potenciais inibidores da cruzaína, foi identificada na literatura uma cistatina da peçonha de Austrelaps superbus (AsCystatin) com ação inibitória sobre a atividade catalítica de cisteíno proteases. Objetivando avaliar as interações in silico deste potencial inibidor com a cruzaína, obteve-se o modelo tridimensional por modelagem por homologia, seguida pela análise de interação por docking molecular, onde foi possível observar que regiões chaves para a atividade catalítica da cruzaína interagem com a AsCystatin. Considerando estes resultados, optou-se por expressar a AsCystatin na sua forma recombinante em bactérias E. coli, obtendo-se a proteína com alto grau de pureza e massa molecular relativa de 13 kDa. Os ensaios seguiram com a avaliação da inibição da AsCystatin sobre a atividade da cruzaína (IAE50), observando-se que 21,2 µM de cistatina inibiu 50% da atividade catalítica da enzima Baseados nas análises in silico realizadas anteriormente, peptídeos originais e modificados foram desenhados e testados, o que permitiu a identificação de 4 peptídeos com capacidade para inibir a atividade enzimática da cruzaína. Por fim, três destes peptídeos mostraram em modelos in vitro, atividade tripanocida sobre formas epimastigotas de T. cruzi. Concluindo, neste trabalho foi possível a identificação da AsCystatin e de quatro peptídeos derivados desta proteína com atividade inibitória sobre a cruzaína, ressaltando ainda o efeito citotóxico associado a estes peptídeos observados em ensaios in vitro sobre o T. cruzi.